Accélération nanoplasmonique de l'amplification des acides nucléiques pour la détection d'agents pathogènes

Nature Nanotechnology volume 18, pages 846-847 (2023)Citer cet article

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Il a été démontré qu’un système automatisé qui associe la microfluidique à l’injection d’électrons chauds plasmoniques pour accélérer la détection colorimétrique de l’amplification de l’ADN et de l’ARN atteint une précision de détection de 95 % dans les échantillons de salive humaine. Cette technique utilise différents tests d’amplification pour l’identification des agents pathogènes et peut différencier les variantes et sous-types viraux.

Les longs protocoles impliqués dans les tests basés sur la détection et la réplication des acides nucléiques via des sondes d'acide nucléique (tests d'amplification) rendent difficile la détection rapide des agents pathogènes au moment où cela est nécessaire, sans parler de l'automatisation du processus depuis la préparation de l'échantillon jusqu'au résultat1. Cette restriction entrave la prise de décision concernant la gestion de la propagation des infections respiratoires virales qui, en raison de leur incidence croissante, affectent de plus en plus la population et l’économie mondiales. Ces limites ont été particulièrement mises en évidence au début de la pandémie de COVID-19, alors qu’un effort mondial était déployé pour développer et utiliser des tests de diagnostic. Actuellement, les tests antigéniques sont les tests de choix pour les situations de besoin en raison de leur fonctionnement simple et rapide. Cependant, les tests antigéniques ont une sensibilité inférieure à celle des tests de réaction en chaîne par polymérase (PCR)2, ce qui entrave leur applicabilité pour éclairer la prise de décision en matière de soins de santé au début de l’infection.

Nous proposons une technique - QolorEX - pour obtenir une lecture colorimétrique quantitative sans marquage à une résolution d'un seul nucléotide, qui peut obtenir un résultat en quelques minutes. Cette approche intègre des tests colorimétriques d'amplification isotherme médiée par boucle de transcription inverse (RT-LAMP) et d'amplification en cercle roulant (RCA) à base de rouge de phénol3 avec des microfluidiques de nanosurface plasmoniques miniaturisées pour obtenir une catalyse de point chaud plasmonique4. Pour rationaliser la réaction d'amplification, nous avons développé une cartouche microfluidique qui utilise un actionnement microfluidique réglable en fonction de l'angle pour intégrer le cycle complet de prélèvement d'échantillons, de lyse, d'ajout de réactifs de test, d'amplification d'acide nucléique et de détection (Fig. 1a). Pour réduire les erreurs introduites par l'utilisateur, nous avons développé un boîtier d'imagerie couplé à l'éclairage avec des actionneurs automatisés pour manipuler, chauffer et imager la cartouche microfluidique sans nécessiter l'intervention de l'utilisateur. Cette automatisation permet à l'utilisateur d'appuyer sur un bouton d'une application de téléphone mobile pour commencer le fonctionnement séquentiel de la cartouche microfluidique. La lecture colorimétrique est automatiquement détectée par la caméra CMOS (Métal-oxyde-semi-conducteur complémentaire) intégrée au boîtier d'imagerie. Un algorithme d'apprentissage automatique analyse ensuite la lecture et établit des résultats positifs ou négatifs ; le résultat est ensuite envoyé sur le téléphone mobile de l'utilisateur.

a, Un schéma du fonctionnement de QolorEX. L'utilisateur crache de la salive dans l'entonnoir de collecte et place la cartouche microfluidique à l'intérieur de la boîte d'imagerie. Les résultats sont ensuite automatiquement relayés via une application smartphone. b, Lors de l'excitation lumineuse, le nanomatériau plasmonique accélère le test d'amplification en raison de l'excès d'électrons à l'interface de réaction. L'augmentation du taux d'amplification augmente le taux de production de protons, ce qui diminue le pH du milieu, provoquant un changement rapide de couleur du rouge de phénol du fuchsia au jaune en présence de l'agent pathogène cible (indiqué dans l'encadré). dNTP, désoxyribonucléotide triphosphate ; DOS, densité d'états ; E, énergie ; EF, énergie de Fermi ; ϕessai, énergie d'initiation de la réaction d'oxydation ; ħω, énergie photonique ; ΔV, volume de la chambre de détection. © 2023, AbdElFatah, T. et al.

Nous avons démontré que la lecture colorimétrique rapide obtenue avec QolorEX dépend fortement de l'injection d'électrons « chauds » excités par la lumière depuis la surface de nanoparticules plasmoniques auto-assemblées dans le mélange d'échantillons et de réactifs de test dans la chambre de détection. Ces électrons chauds accélèrent la réaction nucléophile lors de l'étape de polymérisation de l'amplification, ce qui entraîne à son tour une transformation de la couleur, dépendante du pH, du rouge de phénol, du fuchsia au jaune (Fig. 1b). Nous avons constaté que les surfaces plasmoniques contenant des nanoparticules de 400 nm de diamètre offraient une amélioration du champ électromagnétique plus élevée et des effets de catalyse de point chaud plasmonique associés que les surfaces plasmoniques contenant d'autres tailles de nanoparticules, ce qui entraînait en moyenne une accélération de 9 fois du taux de réaction d'amplification.